架構大鼠生殖毒性半體外篩選模式
- 農業科技計畫 @ 農業部
計畫名稱架構大鼠生殖毒性半體外篩選模式的計畫主持人是呂水淵, 執行機關是行政院農業委員會農業藥物毒物試驗所, 研究領域是植物保護類, 研究性質是技術發展, 計畫編號是112農科-9.1.1-藥-P1(3), 研究目的是發展農林漁牧（不含食品加工與包裝）, 中央款是1664000, 配合款是0, 計畫總經費是1664000, 執行成果摘要是本研究四年來完成免賴得(benomyl)(正對照)、貝芬替(carbendazim)(正對照) 、平克座(penconazole) 、普克利(propiconazole) 、得克利(tebuconazole) 、三泰芬(triadimefon) 、氟他胺(flutamide)(負對照) 、菲克利(h....
| 計畫年度 | 112 |
| 計畫類別 | 科技 |
| 計畫名稱 | 架構大鼠生殖毒性半體外篩選模式 |
| 計畫編號 | 112農科-9.1.1-藥-P1(3) |
| 計畫屬性 | 科學技術類 |
| 研究性質 | 技術發展 |
| 研究方法 | 自行研究 |
| 研究領域 | 植物保護類 |
| 研究目的 | 發展農林漁牧（不含食品加工與包裝） |
| 主管機關 | 農業部農業藥物試驗所 |
| 執行機關 | 行政院農業委員會農業藥物毒物試驗所 |
| 計畫主持人 | 呂水淵 |
| 中央款 | 1664000 |
| 配合款 | 0 |
| 計畫總經費 | 1664000 |
| 執行成果摘要 | 本研究四年來完成免賴得(benomyl)(正對照)、貝芬替(carbendazim)(正對照) 、平克座(penconazole) 、普克利(propiconazole) 、得克利(tebuconazole) 、三泰芬(triadimefon) 、氟他胺(flutamide)(負對照) 、菲克利(hexaconazole) 、待克利(difenoconazole) 、賽滅寧(cypermethrin) 、百滅寧(permethrin) 、第滅寧(deltamethrin) 、嘉磷塞(glyphosate) 、腐絶(thiabendazole)(負對照) 、滅達樂(metalaxyl)及四氯異苯腈(chlorothalonil)等16種農藥或負對照藥劑在大鼠9.5/10.5天胚胎影響測試。結果在外觀檢查，正對照免賴得與貝芬替誘發大鼠胚胎腦部與尾神經管異常，其他農藥則大致僅尾部異常，大多屬正常範圍內，此結果顯示，大鼠胚胎評估方法就出生前發育毒性替代性而言，具替代性功能。測試胚胎分別保存在10%中性福馬林與PBS中分別供免疫染色分析荷爾蒙受體活性與WB方法進行蛋白分析，以建立半體外培養評估大鼠出生前發育毒性。二年重複進行雄性素受體(androgen receptor, AR)、雌性素受體 (estrogen receptor, ERα與ERβ)、甲狀腺素受體(TRα、TRβ)及環化酶(aromatase)之免疫染色分析與西方墨點蛋白表現分析。結果顯示，在免疫染色分析，免賴得(benomyl)、貝芬替(carbendazim)、 平克座(penconazole)、三泰芬(triadimefon)及普克利(propiconazole)具雄性素受體促進反應(androgen receptor agonist)；平克座(penconazole)與三泰芬(triadimefon)具雌性素受體(estrogen receptor α與β)促進反應，普克利(propiconazole)則對雌性素受體(estrogen receptor α)促進反應；平克座(penconazole)與三泰芬(triadimefon)及普克利(propiconazole) 則對甲狀腺素受體(thyroid receptorβ) 促進反應。在蛋白表現分析，免賴得、貝芬替、普克利、得克利、平克座及三泰芬等對雄性素受體促進表現。得克利增加雌性素受體α(long isofrom與short isoform)表現；普克利、賽滅寧及嘉磷塞對雌性素受體α(long isofrom)表現不明顯；賽滅寧也增加雌性素受體α(short isoform)；嘉磷塞則降低雌性素受體α(short isoform)，普克利則輕微表現雌性素受體α(short isoform)。普克利、得克利及賽滅寧均增加雌性素受體β；而嘉磷塞則降低。免賴得、貝芬替、普克利、得克利、平克座及三泰芬等抑制甲狀腺受體α表現而賽滅寧及嘉磷塞則表現不明顯；貝芬替、平克座及三泰芬輕微抑制甲狀腺受體α表現，賽滅寧增加甲狀腺受體β表現而嘉磷塞則輕微表現。免賴得、貝芬替、普克利、得克利、平克座、三泰芬、賽滅寧及嘉磷塞等均增加環化酶表現。為驗證胚胎培養推估農藥誘發生殖毒性與內分泌干擾作用準確性，以貝芬替進行大鼠多代生殖毒性試驗結果顯示，交配前和宮內暴露貝分替和氟他胺對多代大鼠生殖和發育神經毒性的拮抗和協同作用，本研究旨在闡明在交配前和子宮內接觸殺菌劑貝分替、雄激素受體拮抗劑氟他胺或聯合使用是否會誘導生殖和發育神經毒性以及內分泌干擾活性。我們假設在多代大鼠中，貝分替可以誘導雄激素終點和發育神經毒性，並且與氟他胺聯合處理可能是拮抗的或協同的。在交配前 28 天，雄性和雌性親本大鼠分別接受 6.25、12.5、25 和 50 mg/kg bw/day的貝分替，2.5 mg/kg bw/day的氟他胺，或以相同劑量聯合處理。在處理28天後，雄性和雌性大鼠在每個處理組內交配。帶有陰道腟栓的雌性大鼠根據其指定的組繼續藥物處理另外 21 天，這代表了妊娠期。對於 F1 成年大鼠的處理，貝分替誘導胚胎致死；因此，貝分替劑量調整如下（氟他胺劑量保持不變）：單獨貝分替至 1.56、3.13、6.25 和 12.5 mg/kg bw/day；並結合到 6.25 和 12.5 mg/kg bw/day。對於 F2 成年大鼠，為研究內分泌干擾活性，貝分替劑量進一步調整如下：單獨貝分替至 0.39、0.78、1.56、3.13 和 6.25 mg/kg bw/day； 0.78、1.56 和 3.13 mg/kg bw/day。本研究說明，貝分替、氟他胺或聯合處理對多代大鼠的內分泌干擾活性具有拮抗和協同作用，包括肛門生殖器距離、後代體重、陰道開口、包皮分離、癲癇等證據的支持。和生殖器官。對於 F2 後代，1.56 mg/kg bw/day的貝分替處理導致 5% 的雄性癲癇，而 6.25 mg/kg bw/day的貝分替處理導致 3% 的雄性和 10% 的雌性後代癲癇。對於 F3 後代，用 0.78 和 6.25 mg/kg bw/day的貝分替處理分別在 13% 和 20% 的雄性和 15% 和 6% 的雌性中誘發癲癇。此外，氟他胺在 10% 的雌性後代中誘發癲癇。一般來說，我們的數據說明貝分替降低了雄性後代的大腦、垂體、睾丸和陰莖的重量以及陰莖的寬度和長度，而雄性大鼠的附睾重量在 F2 後代中增加，但在 F3 後代中減少。基於上述發現，我們推斷雄激素受體在大鼠癲癇中起重要作用，關注發育神經毒性相關終點至關重要。依據大鼠9.5天胚胎培養後免疫染色分析與蛋白表現分析結果，後續應進行平克座、普克利、賽滅寧、嘉磷塞等在大鼠多代發育中神經毒性試驗，以驗證胚胎半體外篩選方法可預測具發育中神經毒性藥物。 |
計畫年度112 |
計畫類別科技 |
計畫名稱架構大鼠生殖毒性半體外篩選模式 |
計畫編號112農科-9.1.1-藥-P1(3) |
計畫屬性科學技術類 |
研究性質技術發展 |
研究方法自行研究 |
研究領域植物保護類 |
研究目的發展農林漁牧（不含食品加工與包裝） |
主管機關農業部農業藥物試驗所 |
執行機關行政院農業委員會農業藥物毒物試驗所 |
計畫主持人呂水淵 |
中央款1664000 |
配合款0 |
計畫總經費1664000 |
執行成果摘要本研究四年來完成免賴得(benomyl)(正對照)、貝芬替(carbendazim)(正對照) 、平克座(penconazole) 、普克利(propiconazole) 、得克利(tebuconazole) 、三泰芬(triadimefon) 、氟他胺(flutamide)(負對照) 、菲克利(hexaconazole) 、待克利(difenoconazole) 、賽滅寧(cypermethrin) 、百滅寧(permethrin) 、第滅寧(deltamethrin) 、嘉磷塞(glyphosate) 、腐絶(thiabendazole)(負對照) 、滅達樂(metalaxyl)及四氯異苯腈(chlorothalonil)等16種農藥或負對照藥劑在大鼠9.5/10.5天胚胎影響測試。結果在外觀檢查，正對照免賴得與貝芬替誘發大鼠胚胎腦部與尾神經管異常，其他農藥則大致僅尾部異常，大多屬正常範圍內，此結果顯示，大鼠胚胎評估方法就出生前發育毒性替代性而言，具替代性功能。測試胚胎分別保存在10%中性福馬林與PBS中分別供免疫染色分析荷爾蒙受體活性與WB方法進行蛋白分析，以建立半體外培養評估大鼠出生前發育毒性。二年重複進行雄性素受體(androgen receptor, AR)、雌性素受體 (estrogen receptor, ERα與ERβ)、甲狀腺素受體(TRα、TRβ)及環化酶(aromatase)之免疫染色分析與西方墨點蛋白表現分析。結果顯示，在免疫染色分析，免賴得(benomyl)、貝芬替(carbendazim)、 平克座(penconazole)、三泰芬(triadimefon)及普克利(propiconazole)具雄性素受體促進反應(androgen receptor agonist)；平克座(penconazole)與三泰芬(triadimefon)具雌性素受體(estrogen receptor α與β)促進反應，普克利(propiconazole)則對雌性素受體(estrogen receptor α)促進反應；平克座(penconazole)與三泰芬(triadimefon)及普克利(propiconazole) 則對甲狀腺素受體(thyroid receptorβ) 促進反應。在蛋白表現分析，免賴得、貝芬替、普克利、得克利、平克座及三泰芬等對雄性素受體促進表現。得克利增加雌性素受體α(long isofrom與short isoform)表現；普克利、賽滅寧及嘉磷塞對雌性素受體α(long isofrom)表現不明顯；賽滅寧也增加雌性素受體α(short isoform)；嘉磷塞則降低雌性素受體α(short isoform)，普克利則輕微表現雌性素受體α(short isoform)。普克利、得克利及賽滅寧均增加雌性素受體β；而嘉磷塞則降低。免賴得、貝芬替、普克利、得克利、平克座及三泰芬等抑制甲狀腺受體α表現而賽滅寧及嘉磷塞則表現不明顯；貝芬替、平克座及三泰芬輕微抑制甲狀腺受體α表現，賽滅寧增加甲狀腺受體β表現而嘉磷塞則輕微表現。免賴得、貝芬替、普克利、得克利、平克座、三泰芬、賽滅寧及嘉磷塞等均增加環化酶表現。為驗證胚胎培養推估農藥誘發生殖毒性與內分泌干擾作用準確性，以貝芬替進行大鼠多代生殖毒性試驗結果顯示，交配前和宮內暴露貝分替和氟他胺對多代大鼠生殖和發育神經毒性的拮抗和協同作用，本研究旨在闡明在交配前和子宮內接觸殺菌劑貝分替、雄激素受體拮抗劑氟他胺或聯合使用是否會誘導生殖和發育神經毒性以及內分泌干擾活性。我們假設在多代大鼠中，貝分替可以誘導雄激素終點和發育神經毒性，並且與氟他胺聯合處理可能是拮抗的或協同的。在交配前 28 天，雄性和雌性親本大鼠分別接受 6.25、12.5、25 和 50 mg/kg bw/day的貝分替，2.5 mg/kg bw/day的氟他胺，或以相同劑量聯合處理。在處理28天後，雄性和雌性大鼠在每個處理組內交配。帶有陰道腟栓的雌性大鼠根據其指定的組繼續藥物處理另外 21 天，這代表了妊娠期。對於 F1 成年大鼠的處理，貝分替誘導胚胎致死；因此，貝分替劑量調整如下（氟他胺劑量保持不變）：單獨貝分替至 1.56、3.13、6.25 和 12.5 mg/kg bw/day；並結合到 6.25 和 12.5 mg/kg bw/day。對於 F2 成年大鼠，為研究內分泌干擾活性，貝分替劑量進一步調整如下：單獨貝分替至 0.39、0.78、1.56、3.13 和 6.25 mg/kg bw/day； 0.78、1.56 和 3.13 mg/kg bw/day。本研究說明，貝分替、氟他胺或聯合處理對多代大鼠的內分泌干擾活性具有拮抗和協同作用，包括肛門生殖器距離、後代體重、陰道開口、包皮分離、癲癇等證據的支持。和生殖器官。對於 F2 後代，1.56 mg/kg bw/day的貝分替處理導致 5% 的雄性癲癇，而 6.25 mg/kg bw/day的貝分替處理導致 3% 的雄性和 10% 的雌性後代癲癇。對於 F3 後代，用 0.78 和 6.25 mg/kg bw/day的貝分替處理分別在 13% 和 20% 的雄性和 15% 和 6% 的雌性中誘發癲癇。此外，氟他胺在 10% 的雌性後代中誘發癲癇。一般來說，我們的數據說明貝分替降低了雄性後代的大腦、垂體、睾丸和陰莖的重量以及陰莖的寬度和長度，而雄性大鼠的附睾重量在 F2 後代中增加，但在 F3 後代中減少。基於上述發現，我們推斷雄激素受體在大鼠癲癇中起重要作用，關注發育神經毒性相關終點至關重要。依據大鼠9.5天胚胎培養後免疫染色分析與蛋白表現分析結果，後續應進行平克座、普克利、賽滅寧、嘉磷塞等在大鼠多代發育中神經毒性試驗，以驗證胚胎半體外篩選方法可預測具發育中神經毒性藥物。 |