建立農藥毒理評估替代試驗模式
- 農業科技計畫 @ 農業部
計畫名稱建立農藥毒理評估替代試驗模式的計畫主持人是楊俊宏, 執行機關是行政院農業委員會農業藥物毒物試驗所, 研究領域是植物保護類, 研究性質是應用研究, 計畫編號是109農科-24.1.2-藥-P1(Z), 研究目的是發展農林漁牧（不含食品加工與包裝）, 中央款是7536000, 配合款是0, 計畫總經費是7536000, 執行成果摘要是「建立農藥毒理評估替代試驗模式」之中文摘要：一、「建立大鼠出生前發育毒性半體外替代試驗模式」本研究完成免賴得(benomyl)(正對照)、貝芬替(carbendazim)(正對照) 、平克座(penconazole) 、普克利(propiconazole) 、得克利(tebuconazole) 、三....
| 計畫年度 | 109 |
| 計畫類別 | 科技 |
| 計畫名稱 | 建立農藥毒理評估替代試驗模式 |
| 計畫編號 | 109農科-24.1.2-藥-P1(Z) |
| 計畫屬性 | 科學技術類 |
| 研究性質 | 應用研究 |
| 研究方法 | 自行研究 |
| 研究領域 | 植物保護類 |
| 研究目的 | 發展農林漁牧（不含食品加工與包裝） |
| 主管機關 | 農委會農業藥物毒物試驗所 |
| 執行機關 | 行政院農業委員會農業藥物毒物試驗所 |
| 計畫主持人 | 楊俊宏 |
| 中央款 | 7536000 |
| 配合款 | 0 |
| 計畫總經費 | 7536000 |
| 執行成果摘要 | 「建立農藥毒理評估替代試驗模式」之中文摘要：一、「建立大鼠出生前發育毒性半體外替代試驗模式」本研究完成免賴得(benomyl)(正對照)、貝芬替(carbendazim)(正對照) 、平克座(penconazole) 、普克利(propiconazole) 、得克利(tebuconazole) 、三泰芬(triadimefon) 、氟他胺(flutamide) 、菲克利(hexaconazole) 、待克利(difenoconazole) 、賽滅寧(cypermethrin) 、百滅寧(permethrin) 、第滅寧(deltamethrin) 、嘉磷塞(glyphosate) 、腐絶(thiabendazole) 、滅達樂(metalaxyl)及四氯異苯腈(chlorothalonil)等16種農藥或負對照藥劑在大鼠10.5天胚胎影響測試。結果在外觀檢查，正對照貝芬替誘發大鼠胚胎腦部與尾神經管異常，其他農藥則大多僅尾部輕微異常，多屬正常範圍內，且無劑量反應關係，此結果顯示，此與上述農藥在文獻報告活體內出生前發育毒性測試結果一致，顯見大鼠9.5或10.5天半體外胚胎培養方法評估出生前發育毒之可行性。測試胚胎分別保存在10%中性福馬林與PBS中分別供免疫染色分析荷爾蒙受體活性與WB方法進行蛋白分析，以建立半體外培養評估大鼠出生前發育毒性。將進行雄性素受體(androgen receptor, AR)、雌性素受體 (estrogen receptor, ERα與ERβ)、甲狀腺素受體(TRα、TRβ)及環化酶(aromatase)之免疫染色分析。二、「國際認可農藥對水生生物短期毒性評估之替代試驗模式研析」首先今年針對國際上農藥對水生短期評估之可替代試驗模式相關資料進行收集。在魚類急毒性主要以OECD TG203 （魚類急毒性試驗方法）指引為主，此指引於2019年發表最新針對3R之減量原則修訂OECD TG203指引，故與國際接軌本組亦修訂OECD TG203之試驗標準操作程序（SOP），並進行實驗室教育訓練。現今國際上針對魚類短期毒性認可可替代方法主要以OECD TG236 （斑馬魚胚胎急毒性測試方法）指引為主，理由為：利用體外受精魚卵進行毒性試驗，屬於體外試驗，美國NIH及歐盟將斑馬魚自孵化後並開始接受餵食才視為活體動物，故斑馬魚5 dpf (days post fertilization)之前的胚胎並不納入實驗動物照顧及使用指引規範，且在這期間魚尚未有痛覺與知覺。本實驗室對OECD TG236 （2013）英文版本進行中文指引撰寫初稿，進行試驗流程初步建立，並以撲滅松原體對斑馬魚胚胎毒性與幼魚進行96小時急毒性試驗，試驗結果胚胎毒性LC50: ＞1.6mg/L，幼魚毒性LC50: 3.56 mg/L，後續並執行國際相關文獻研究進行組內簡報之探討。三、「建立非基因毒性途徑致腫瘤農藥之動物替代檢測體系」台灣管理機構非常重視農藥是否具有誘發腫瘤的潛力。為評估農藥透過非基因毒性塗徑所導致肝致腫瘤性之潛能，建立了快速部分肝切除動物模式等非基因毒性途徑致腫瘤農藥之動物替代檢測體系。相較於小鼠長期致腫瘤性試驗，該動物模式需要的動物更少，而且試驗時間從18個月減少到8週。這項研究的目的是建立快速部分肝切除動物模式或其它新穎性替代動物試驗，以取代小鼠的小鼠長期致腫瘤性試驗並達到動物3R福址原則的目標。給藥前，所有大鼠均接受約70%的部分肝切除手術。結果顯示，與空白對照組相較，diethylnitrosamine和2-acetylaminofluorene陽性對照組在肝臟表面誘發出明顯的肝腫瘤病灶，並導至致γ-GT活性顯著上升（p ＜0.05）。這項根據動物福址3R原則所執行的研究將可提供相關農藥是否透過非基因途徑致腫瘤風險的重要信息。四、「建立非基因毒性途徑致腫瘤農藥之細胞替代檢測體系」目前國內外對於登記農藥是否具致腫瘤性的預測性試驗，均以致變異性試驗 (基因毒性途徑) 為主；對於非基因毒性途徑的致腫瘤性潛力評估卻無太大的著墨，因而造成許多不必要且昂貴的動物腫瘤試驗被執行。擬透過建立非基因毒性致腫瘤性潛力體外方法，完善現行農藥登記致變異性試驗需求，更精準化致腫瘤性潛力預測結果，以減少不必要之動物試驗。目前，我們已經精緻化 (refine) 在實驗室中進行了多年的小鼠紅細胞微核試驗的流程，在依循OECD試驗準則 (OECD TG 474, 2016) 前提下，改以使用單性動物並且減少了採樣次數，結果顯示依循新的流程進行試驗可減少50%動物使用、50%人員參與、74%時間花費和33%成本。另一方面，我們還收集了至少三種細胞轉化試驗方法 (SHE，Balbc / 3T3和Bhas 42)，並比較了這些測試系統的優缺點，最終選擇以Bhas 42進行進一步研究。並將兩份英語版本之OECD細胞轉化測定指南翻譯成中文，它們將成為將來建立全新測試系統的主要參考。 |
計畫年度109 |
計畫類別科技 |
計畫名稱建立農藥毒理評估替代試驗模式 |
計畫編號109農科-24.1.2-藥-P1(Z) |
計畫屬性科學技術類 |
研究性質應用研究 |
研究方法自行研究 |
研究領域植物保護類 |
研究目的發展農林漁牧（不含食品加工與包裝） |
主管機關農委會農業藥物毒物試驗所 |
執行機關行政院農業委員會農業藥物毒物試驗所 |
計畫主持人楊俊宏 |
中央款7536000 |
配合款0 |
計畫總經費7536000 |
執行成果摘要「建立農藥毒理評估替代試驗模式」之中文摘要：一、「建立大鼠出生前發育毒性半體外替代試驗模式」本研究完成免賴得(benomyl)(正對照)、貝芬替(carbendazim)(正對照) 、平克座(penconazole) 、普克利(propiconazole) 、得克利(tebuconazole) 、三泰芬(triadimefon) 、氟他胺(flutamide) 、菲克利(hexaconazole) 、待克利(difenoconazole) 、賽滅寧(cypermethrin) 、百滅寧(permethrin) 、第滅寧(deltamethrin) 、嘉磷塞(glyphosate) 、腐絶(thiabendazole) 、滅達樂(metalaxyl)及四氯異苯腈(chlorothalonil)等16種農藥或負對照藥劑在大鼠10.5天胚胎影響測試。結果在外觀檢查，正對照貝芬替誘發大鼠胚胎腦部與尾神經管異常，其他農藥則大多僅尾部輕微異常，多屬正常範圍內，且無劑量反應關係，此結果顯示，此與上述農藥在文獻報告活體內出生前發育毒性測試結果一致，顯見大鼠9.5或10.5天半體外胚胎培養方法評估出生前發育毒之可行性。測試胚胎分別保存在10%中性福馬林與PBS中分別供免疫染色分析荷爾蒙受體活性與WB方法進行蛋白分析，以建立半體外培養評估大鼠出生前發育毒性。將進行雄性素受體(androgen receptor, AR)、雌性素受體 (estrogen receptor, ERα與ERβ)、甲狀腺素受體(TRα、TRβ)及環化酶(aromatase)之免疫染色分析。二、「國際認可農藥對水生生物短期毒性評估之替代試驗模式研析」首先今年針對國際上農藥對水生短期評估之可替代試驗模式相關資料進行收集。在魚類急毒性主要以OECD TG203 （魚類急毒性試驗方法）指引為主，此指引於2019年發表最新針對3R之減量原則修訂OECD TG203指引，故與國際接軌本組亦修訂OECD TG203之試驗標準操作程序（SOP），並進行實驗室教育訓練。現今國際上針對魚類短期毒性認可可替代方法主要以OECD TG236 （斑馬魚胚胎急毒性測試方法）指引為主，理由為：利用體外受精魚卵進行毒性試驗，屬於體外試驗，美國NIH及歐盟將斑馬魚自孵化後並開始接受餵食才視為活體動物，故斑馬魚5 dpf (days post fertilization)之前的胚胎並不納入實驗動物照顧及使用指引規範，且在這期間魚尚未有痛覺與知覺。本實驗室對OECD TG236 （2013）英文版本進行中文指引撰寫初稿，進行試驗流程初步建立，並以撲滅松原體對斑馬魚胚胎毒性與幼魚進行96小時急毒性試驗，試驗結果胚胎毒性LC50: ＞1.6mg/L，幼魚毒性LC50: 3.56 mg/L，後續並執行國際相關文獻研究進行組內簡報之探討。三、「建立非基因毒性途徑致腫瘤農藥之動物替代檢測體系」台灣管理機構非常重視農藥是否具有誘發腫瘤的潛力。為評估農藥透過非基因毒性塗徑所導致肝致腫瘤性之潛能，建立了快速部分肝切除動物模式等非基因毒性途徑致腫瘤農藥之動物替代檢測體系。相較於小鼠長期致腫瘤性試驗，該動物模式需要的動物更少，而且試驗時間從18個月減少到8週。這項研究的目的是建立快速部分肝切除動物模式或其它新穎性替代動物試驗，以取代小鼠的小鼠長期致腫瘤性試驗並達到動物3R福址原則的目標。給藥前，所有大鼠均接受約70%的部分肝切除手術。結果顯示，與空白對照組相較，diethylnitrosamine和2-acetylaminofluorene陽性對照組在肝臟表面誘發出明顯的肝腫瘤病灶，並導至致γ-GT活性顯著上升（p ＜0.05）。這項根據動物福址3R原則所執行的研究將可提供相關農藥是否透過非基因途徑致腫瘤風險的重要信息。四、「建立非基因毒性途徑致腫瘤農藥之細胞替代檢測體系」目前國內外對於登記農藥是否具致腫瘤性的預測性試驗，均以致變異性試驗 (基因毒性途徑) 為主；對於非基因毒性途徑的致腫瘤性潛力評估卻無太大的著墨，因而造成許多不必要且昂貴的動物腫瘤試驗被執行。擬透過建立非基因毒性致腫瘤性潛力體外方法，完善現行農藥登記致變異性試驗需求，更精準化致腫瘤性潛力預測結果，以減少不必要之動物試驗。目前，我們已經精緻化 (refine) 在實驗室中進行了多年的小鼠紅細胞微核試驗的流程，在依循OECD試驗準則 (OECD TG 474, 2016) 前提下，改以使用單性動物並且減少了採樣次數，結果顯示依循新的流程進行試驗可減少50%動物使用、50%人員參與、74%時間花費和33%成本。另一方面，我們還收集了至少三種細胞轉化試驗方法 (SHE，Balbc / 3T3和Bhas 42)，並比較了這些測試系統的優缺點，最終選擇以Bhas 42進行進一步研究。並將兩份英語版本之OECD細胞轉化測定指南翻譯成中文，它們將成為將來建立全新測試系統的主要參考。 |