基因改造作物環境風險評估
- 農業科技計畫 @ 農業部
計畫名稱基因改造作物環境風險評估的計畫主持人是曾清山, 執行機關是行政院農業委員會農業試驗所, 研究領域是農-生物技術, 研究性質是基礎研究, 計畫編號是109農科-1.3.4-農-C1, 研究目的是發展農林漁牧（不含食品加工與包裝）, 中央款是9499000, 配合款是0, 計畫總經費是9499000, 執行成果摘要是1.基因改造作物遺傳性狀調查先期試驗合作案件。(1).利用遺傳及遺傳工程方法改善水稻氮利用效率。為了增強水稻中的氮肥利用效率，使用NRT1.7 / OsYSL16 或NRT1.11的啟動子來驅動一個高活性的合成硝酸鹽轉運蛋白NC4N 的基因表現，藉此提高硝酸鹽重新分配效率。本年度二期作總計有1個NR....
| 計畫年度 | 109 |
| 計畫類別 | 科技 |
| 計畫名稱 | 基因改造作物環境風險評估 |
| 計畫編號 | 109農科-1.3.4-農-C1 |
| 計畫屬性 | 科學技術類 |
| 研究性質 | 基礎研究 |
| 研究方法 | 自行研究 |
| 研究領域 | 農-生物技術 |
| 研究目的 | 發展農林漁牧（不含食品加工與包裝） |
| 主管機關 | 農委會農業試驗所 |
| 執行機關 | 行政院農業委員會農業試驗所 |
| 計畫主持人 | 曾清山 |
| 中央款 | 9499000 |
| 配合款 | 0 |
| 計畫總經費 | 9499000 |
| 執行成果摘要 | 1.基因改造作物遺傳性狀調查先期試驗合作案件。(1).利用遺傳及遺傳工程方法改善水稻氮利用效率。為了增強水稻中的氮肥利用效率，使用NRT1.7 / OsYSL16 或NRT1.11的啟動子來驅動一個高活性的合成硝酸鹽轉運蛋白NC4N 的基因表現，藉此提高硝酸鹽重新分配效率。本年度二期作總計有1個NRT1.7p::NC4N::3'，3個NRT1.11p::NC4N::3'，8個OsYSL16p::NC4N::3'轉殖品系進行肥料試驗，已完成株高、分蘗數和抽穗期調查，產量構成要素性狀穗數、千粒重、稔實率和一穗粒數，預計將於12月底前完成資料收集與統計分析。 (2).水稻氮代謝相關調控基因之研究。利用可以調控水稻對有機碳、氮肥利用效率的關鍵基因。試驗材料為利用改變對氮反應基因 ZOS5-02之水稻，藉由不同氮肥施用量等級，探討水稻各生育時期之氮利用效率及其在農藝性狀和產量性狀之表現情形，藉此找到氮肥利用效率更好的新品種。試驗結果顯示所有參試品系之株高隨施氮量施用量增加而增加。稔實率和千粒重隨施氮肥施用量遞增呈遞減趨勢。所有參試品系之穗數、一穗粒數及產量皆隨施氮量施用量增加呈增加之趨勢。 (3).含有活性胜肽及乳鐵蛋白之營養強化水稻優良品種選育。a.活性胜肽Val-Val-Tyr-Pro(VVYP)為抑制腸道吸收三酸甘油脂的主要因子，其可藉由抑制腸道吸收脂肪並且提升肝臟脂解酶的活性來達到降低血脂的效果。本研究利用VVYP之Gy1-7VP及Gy5-10VP轉殖基因水稻共11個品系進行遺傳特性調查，結果顯示各項農藝性狀及遺傳特性與親本台農67號相似，且能穩定表達VVYP蛋白。b.經基因編輯後具有矮化及耐逆境功能的水稻品種開發及應用。基因編輯性狀包括穗密度、每穗粒數、穀粒大小、穀粒重、植株矮化、抗稻熱病、抗褐飛蝨、米粒香味等。總計完成114個水稻基因編輯品系田間隔離栽培、性狀調查及繁殖。預計於110年進行各品系遺傳特性調查與目標性狀評估。 (4).以CRISP/Cas技術編輯水稻EPSPS基因成為抗除草劑嘉磷塞。本研究以CRISPR/Cas9 為工具編輯水稻內生EPSPS 基因，達到抗嘉磷塞之目的。利用突變造成基因失去功能，單點突變乃修飾水稻EPSPS蛋白之proline177改為serine或threonine，雙點突變乃修飾水稻EPSPS 蛋白之glycine172 改為alanine、glycine215 改為aspartic acid；雖然CRISPR/Cas9 技術之編輯結果大多為插入/缺失(insertion/deletion)，只要EPSPS 之對偶基因其中之一成功，即可在水稻癒合組織時期以嘉磷塞篩選，所以篩選效率(比隱性突變)高。本年度有8個品系進行隔離栽培及繁殖，預計下一年度進行目標性狀田間試驗。 (5).輕症病毒疫苗防治矮南瓜黃化嵌紋病毒之研究。本試驗於Mock處理組檢測出感染強症型ZYMV的植株，全園之ZYMV發生率為4.65%。雖於試驗田中可發現疑似感染病毒的植株，但檢測結果顯示，僅於Mock處理組檢測到ZYMV感染，檢出率為23.07%。處理ZAC疫苗之實驗組(A、B、C) 皆未檢出ZYMV。本試驗結果顯示，ZAC疫苗具有交互保護效果。 (6).ZAC輕症病毒疫苗防治木瓜輪點病毒之研究。接種輕症疫苗的木瓜所產生的果實，與對照組比較，並沒有太大差異，但因輕症疫苗的木瓜植株較晚發病，整體果實產量比對照組高。試驗結果顯示，接種輕症疫苗的木瓜在梅雨季前有延後感病的現象，而梅雨季過後發病情況明顯增加。果實部份並沒有太大差異，但產量比對照組高。若能在梅雨季時，將木瓜植株的生長勢控制好，應可再提升總產量。 (7).抗木瓜輪點病毒基改大日陞木瓜品系選拔研究。本年度共有7個抗木瓜輪點病毒(Papaya ringspot virus，PRSV)基改大日陞木瓜品系做為比較，透過果形、果實的大小、甜度、風味可分為台二果型和日陞果型二大類。本年度基改大日陞木瓜品系選拔結果以10-9品系和5-6品系的果型佳、甜度高、風味好為最符合市場需求。 2.建立基改作物環境風險評估技術。(1).基改水稻病害或微生物環境風險評估試驗，調查基改水稻與病害之關係及影響，以及病害發生種類。本試驗土壤樣品中微生物多樣性，利用 DGGE分析將土壤所萃取而得的微生物核酸以細菌 16S rDNA專一引子進行 PCR增幅，增幅之基因片段隨微生物物種不同而基因序列有所不同，藉由 DGGE法進行電泳可以將不同序列之 PCR產物條帶分離，由電泳結果觀察到的多條帶表示不同微生物物種之基因片段。試驗結果顯示，分別由不同水稻品種種植之土壤樣品電泳在同一膠片上，由DGGE 圖譜中發現，以轉殖系周邊土壤與非轉殖系之條亮帶相似，顯示細菌菌落屬於同一群菌相且水稻殘體或遺傳物質對微生物影響程度不大。已開發出可鑑定紋枯病菌經由方法最佳化試驗及紋枯病菌增幅產物為117bp;紋枯病菌專一性引子 F/R以核酸擴增技術可以鑑定感染紋枯病菌之水稻，並可以區分其他之稻熱病、水稻白葉枯病及水稻徒長病菌等，基改水稻代號C1-1; C1-2; LIIS1802; LIIS18-2; HiSII-1; HiSII-2; Space1; Space2檢出紋枯病菌基因片段顯示遭受感染。 (2).應用次世代定序技術分析土壤微生物相的變動(第二年)。本試驗利用OTUs個別物種組成資料，分別計算種植前後土壤樣本中細菌和真菌的Chao1指數、辛普森指數倒數及夏農指數，將五重複之樣本取平均並計算標準差。結果顯示，a.細菌的Chao1指數不因種植前(d0)與種植後(d90)產生太大的波動，且各組別Chao1數值無明顯差異。另觀察到對照組與基改組於種植前辛普森指數倒數與夏農指數高於空白組，而種植後之基改組樣本指數數值與空白組無顯著差異，對照組則低於兩者，代表較容易受環境干擾影響該區域物種均勻度。綜合以上結果顯示種植基改與非基改馬鈴薯並不會顯著改變細菌生物多樣性，數值造成主要來自於個體差異，而非是否為基改馬鈴薯品系。b.真菌的chao1指數不論是空白組、對照組或基改組，d90的數值顯著高於d0，但各組別間無顯著差異，顯示此試驗中真菌族群豐度的提高主要受到環境因素影響。代表真菌物種多樣性的辛普森指數與夏農指數的數據變化趨勢類似chao1指數。d90的兩項多樣性指數顯著均高於d0，且各組間的數據均無顯著差異。綜合以上結果顯示種植基改與非基改馬鈴薯並不會顯著改變細菌與真菌的豐度與均勻度，數值造成差異的主要原因為環境因素及人為管理因素。c.利用PCoA(Principal coordinates analysis)分析馬鈴薯栽種前後土壤細菌族群結構的變化，細菌的微生物組成比例並無明顯變化。不論d0期或d90期，對照組和基改馬鈴薯的根圈土壤微生物相無顯著差異。 3.新興生物技術安全評估案例研析。(1).目前監管體系可分成產品導向 (product-based) 與製程導向 (process-based)，前者以美國為主，取決於最終改良生物體(Living Modified Organism, LMO)是否殘留相關遺傳材料；後者則以歐盟 (EU) 為主，認為不論是否有新遺傳物質殘留，只要過程中涉及「獲取新的重組遺傳物質」，仍符合議定書中LMO定義。 (2).美國農業部動植物檢疫局APHIS於109年5月18日發佈新修訂之7 CFR part 340 - 生物技術規則(SECURE Rule)，目的在科學性監管前提下，保護農業之永續發展。SECURE規則定義基因工程為「使用重組，合成或擴增的核酸來修飾或創建基因組的技術」，除包括傳統的轉基因遺傳工程之外，也涵蓋目前較新的基因編輯技術如CRISPR。其許可範圍包括單一鹼基替換、引入近緣植物基因序列、最終產品不含外源基因，供開發者/育種者檢視是否受受基改法規或計劃性規範。目前生物技術規則已分段實施，並將於110年10月1日起全面實施。 (3).根據歐洲法院《第2001/18/EC 號指令》的判決，新興育種技術仍可能與GMO有一樣的風險存在。2019年歐盟理事會根據法院在C-528 / 16號案件中的判決，要求委員會就新興基因組技術提出研究報告，對於新興基因編輯技術在確認檢測方法前，在2021年4月完成計畫前將不會採取任何進一步措施來更新法規。 (4).基因編輯作物在日本，主要受到兩種法規的規範，分別是由環境省 (MOE) 主管的《卡塔赫納法》，與厚生勞動省 (MHLW) 主管的《食品衛生法 (Food Sanitation Act)》。《卡塔赫納法》的規範大多與美、澳兩國相似，《食品衛生法》依據「是否含有外源基因，且基因編輯的序列改變是否在自然突變的許可範圍內」來作為判定標準。 (5).台灣基因編輯管理規範現行基改植物之實驗研發由國科會依《基因重組實驗守則》主管，依現行法規定義為考量依據，基因編輯生物應該被視作基改生物而受規範:a.多數基因編輯植物採用CRISPR系統，符合《基因重組實驗守則》定義之基因轉殖植物。b.即使經過篩選剃除外源基因(啟動子與Cas9基因)，其子代在田間試驗階段應受《基因轉移植物田間試驗管理規範》第二條第四項「基因轉殖作物包含其衍生之後代」所規範管理。 4.隔離田間試驗設施營運管理。農委會於109年7月28日委託臺灣大學訪視本所基因轉殖植物田間試驗隔離設施建議改善事項，提出對應改善措施。本所已依建議事項完成改善。 5.基改作物隔離設施活化利用。對於農業生產而言，極端天氣變化， 使得糧食生產環境變得更為挑戰， 進而影響糧食供應的不確定性 ，牽動著國內外糧食供應政策與應變機制。建置能控制栽培環境的篩選平台，期能在多變的環境下瞭解其對作物的影響，進而提出對應的調適作為，以確保農業生產安全。配合作物溫度逆境研究需求，利用密閉溫室之人工光源室已完成水稻低溫逆境篩選設施平台建置，未來將進行水稻苗期低溫韌性篩選研究及抽穗期低溫逆境調適作為，以減少水稻溫度逆境損失，提升水稻育種選拔效率和隔離設施使用率。110年度將持續規劃建置高溫、高CO2濃度篩選設施，提升隔離設施使用率。目前已完成水稻高溫、高CO2濃度、多重逆境篩選設施資料蒐集、場域整理及規劃。 |
計畫年度109 |
計畫類別科技 |
計畫名稱基因改造作物環境風險評估 |
計畫編號109農科-1.3.4-農-C1 |
計畫屬性科學技術類 |
研究性質基礎研究 |
研究方法自行研究 |
研究領域農-生物技術 |
研究目的發展農林漁牧（不含食品加工與包裝） |
主管機關農委會農業試驗所 |
執行機關行政院農業委員會農業試驗所 |
計畫主持人曾清山 |
中央款9499000 |
配合款0 |
計畫總經費9499000 |
執行成果摘要1.基因改造作物遺傳性狀調查先期試驗合作案件。(1).利用遺傳及遺傳工程方法改善水稻氮利用效率。為了增強水稻中的氮肥利用效率，使用NRT1.7 / OsYSL16 或NRT1.11的啟動子來驅動一個高活性的合成硝酸鹽轉運蛋白NC4N 的基因表現，藉此提高硝酸鹽重新分配效率。本年度二期作總計有1個NRT1.7p::NC4N::3'，3個NRT1.11p::NC4N::3'，8個OsYSL16p::NC4N::3'轉殖品系進行肥料試驗，已完成株高、分蘗數和抽穗期調查，產量構成要素性狀穗數、千粒重、稔實率和一穗粒數，預計將於12月底前完成資料收集與統計分析。 (2).水稻氮代謝相關調控基因之研究。利用可以調控水稻對有機碳、氮肥利用效率的關鍵基因。試驗材料為利用改變對氮反應基因 ZOS5-02之水稻，藉由不同氮肥施用量等級，探討水稻各生育時期之氮利用效率及其在農藝性狀和產量性狀之表現情形，藉此找到氮肥利用效率更好的新品種。試驗結果顯示所有參試品系之株高隨施氮量施用量增加而增加。稔實率和千粒重隨施氮肥施用量遞增呈遞減趨勢。所有參試品系之穗數、一穗粒數及產量皆隨施氮量施用量增加呈增加之趨勢。 (3).含有活性胜肽及乳鐵蛋白之營養強化水稻優良品種選育。a.活性胜肽Val-Val-Tyr-Pro(VVYP)為抑制腸道吸收三酸甘油脂的主要因子，其可藉由抑制腸道吸收脂肪並且提升肝臟脂解酶的活性來達到降低血脂的效果。本研究利用VVYP之Gy1-7VP及Gy5-10VP轉殖基因水稻共11個品系進行遺傳特性調查，結果顯示各項農藝性狀及遺傳特性與親本台農67號相似，且能穩定表達VVYP蛋白。b.經基因編輯後具有矮化及耐逆境功能的水稻品種開發及應用。基因編輯性狀包括穗密度、每穗粒數、穀粒大小、穀粒重、植株矮化、抗稻熱病、抗褐飛蝨、米粒香味等。總計完成114個水稻基因編輯品系田間隔離栽培、性狀調查及繁殖。預計於110年進行各品系遺傳特性調查與目標性狀評估。 (4).以CRISP/Cas技術編輯水稻EPSPS基因成為抗除草劑嘉磷塞。本研究以CRISPR/Cas9 為工具編輯水稻內生EPSPS 基因，達到抗嘉磷塞之目的。利用突變造成基因失去功能，單點突變乃修飾水稻EPSPS蛋白之proline177改為serine或threonine，雙點突變乃修飾水稻EPSPS 蛋白之glycine172 改為alanine、glycine215 改為aspartic acid；雖然CRISPR/Cas9 技術之編輯結果大多為插入/缺失(insertion/deletion)，只要EPSPS 之對偶基因其中之一成功，即可在水稻癒合組織時期以嘉磷塞篩選，所以篩選效率(比隱性突變)高。本年度有8個品系進行隔離栽培及繁殖，預計下一年度進行目標性狀田間試驗。 (5).輕症病毒疫苗防治矮南瓜黃化嵌紋病毒之研究。本試驗於Mock處理組檢測出感染強症型ZYMV的植株，全園之ZYMV發生率為4.65%。雖於試驗田中可發現疑似感染病毒的植株，但檢測結果顯示，僅於Mock處理組檢測到ZYMV感染，檢出率為23.07%。處理ZAC疫苗之實驗組(A、B、C) 皆未檢出ZYMV。本試驗結果顯示，ZAC疫苗具有交互保護效果。 (6).ZAC輕症病毒疫苗防治木瓜輪點病毒之研究。接種輕症疫苗的木瓜所產生的果實，與對照組比較，並沒有太大差異，但因輕症疫苗的木瓜植株較晚發病，整體果實產量比對照組高。試驗結果顯示，接種輕症疫苗的木瓜在梅雨季前有延後感病的現象，而梅雨季過後發病情況明顯增加。果實部份並沒有太大差異，但產量比對照組高。若能在梅雨季時，將木瓜植株的生長勢控制好，應可再提升總產量。 (7).抗木瓜輪點病毒基改大日陞木瓜品系選拔研究。本年度共有7個抗木瓜輪點病毒(Papaya ringspot virus，PRSV)基改大日陞木瓜品系做為比較，透過果形、果實的大小、甜度、風味可分為台二果型和日陞果型二大類。本年度基改大日陞木瓜品系選拔結果以10-9品系和5-6品系的果型佳、甜度高、風味好為最符合市場需求。 2.建立基改作物環境風險評估技術。(1).基改水稻病害或微生物環境風險評估試驗，調查基改水稻與病害之關係及影響，以及病害發生種類。本試驗土壤樣品中微生物多樣性，利用 DGGE分析將土壤所萃取而得的微生物核酸以細菌 16S rDNA專一引子進行 PCR增幅，增幅之基因片段隨微生物物種不同而基因序列有所不同，藉由 DGGE法進行電泳可以將不同序列之 PCR產物條帶分離，由電泳結果觀察到的多條帶表示不同微生物物種之基因片段。試驗結果顯示，分別由不同水稻品種種植之土壤樣品電泳在同一膠片上，由DGGE 圖譜中發現，以轉殖系周邊土壤與非轉殖系之條亮帶相似，顯示細菌菌落屬於同一群菌相且水稻殘體或遺傳物質對微生物影響程度不大。已開發出可鑑定紋枯病菌經由方法最佳化試驗及紋枯病菌增幅產物為117bp;紋枯病菌專一性引子 F/R以核酸擴增技術可以鑑定感染紋枯病菌之水稻，並可以區分其他之稻熱病、水稻白葉枯病及水稻徒長病菌等，基改水稻代號C1-1; C1-2; LIIS1802; LIIS18-2; HiSII-1; HiSII-2; Space1; Space2檢出紋枯病菌基因片段顯示遭受感染。 (2).應用次世代定序技術分析土壤微生物相的變動(第二年)。本試驗利用OTUs個別物種組成資料，分別計算種植前後土壤樣本中細菌和真菌的Chao1指數、辛普森指數倒數及夏農指數，將五重複之樣本取平均並計算標準差。結果顯示，a.細菌的Chao1指數不因種植前(d0)與種植後(d90)產生太大的波動，且各組別Chao1數值無明顯差異。另觀察到對照組與基改組於種植前辛普森指數倒數與夏農指數高於空白組，而種植後之基改組樣本指數數值與空白組無顯著差異，對照組則低於兩者，代表較容易受環境干擾影響該區域物種均勻度。綜合以上結果顯示種植基改與非基改馬鈴薯並不會顯著改變細菌生物多樣性，數值造成主要來自於個體差異，而非是否為基改馬鈴薯品系。b.真菌的chao1指數不論是空白組、對照組或基改組，d90的數值顯著高於d0，但各組別間無顯著差異，顯示此試驗中真菌族群豐度的提高主要受到環境因素影響。代表真菌物種多樣性的辛普森指數與夏農指數的數據變化趨勢類似chao1指數。d90的兩項多樣性指數顯著均高於d0，且各組間的數據均無顯著差異。綜合以上結果顯示種植基改與非基改馬鈴薯並不會顯著改變細菌與真菌的豐度與均勻度，數值造成差異的主要原因為環境因素及人為管理因素。c.利用PCoA(Principal coordinates analysis)分析馬鈴薯栽種前後土壤細菌族群結構的變化，細菌的微生物組成比例並無明顯變化。不論d0期或d90期，對照組和基改馬鈴薯的根圈土壤微生物相無顯著差異。 3.新興生物技術安全評估案例研析。(1).目前監管體系可分成產品導向 (product-based) 與製程導向 (process-based)，前者以美國為主，取決於最終改良生物體(Living Modified Organism, LMO)是否殘留相關遺傳材料；後者則以歐盟 (EU) 為主，認為不論是否有新遺傳物質殘留，只要過程中涉及「獲取新的重組遺傳物質」，仍符合議定書中LMO定義。 (2).美國農業部動植物檢疫局APHIS於109年5月18日發佈新修訂之7 CFR part 340 - 生物技術規則(SECURE Rule)，目的在科學性監管前提下，保護農業之永續發展。SECURE規則定義基因工程為「使用重組，合成或擴增的核酸來修飾或創建基因組的技術」，除包括傳統的轉基因遺傳工程之外，也涵蓋目前較新的基因編輯技術如CRISPR。其許可範圍包括單一鹼基替換、引入近緣植物基因序列、最終產品不含外源基因，供開發者/育種者檢視是否受受基改法規或計劃性規範。目前生物技術規則已分段實施，並將於110年10月1日起全面實施。 (3).根據歐洲法院《第2001/18/EC 號指令》的判決，新興育種技術仍可能與GMO有一樣的風險存在。2019年歐盟理事會根據法院在C-528 / 16號案件中的判決，要求委員會就新興基因組技術提出研究報告，對於新興基因編輯技術在確認檢測方法前，在2021年4月完成計畫前將不會採取任何進一步措施來更新法規。 (4).基因編輯作物在日本，主要受到兩種法規的規範，分別是由環境省 (MOE) 主管的《卡塔赫納法》，與厚生勞動省 (MHLW) 主管的《食品衛生法 (Food Sanitation Act)》。《卡塔赫納法》的規範大多與美、澳兩國相似，《食品衛生法》依據「是否含有外源基因，且基因編輯的序列改變是否在自然突變的許可範圍內」來作為判定標準。 (5).台灣基因編輯管理規範現行基改植物之實驗研發由國科會依《基因重組實驗守則》主管，依現行法規定義為考量依據，基因編輯生物應該被視作基改生物而受規範:a.多數基因編輯植物採用CRISPR系統，符合《基因重組實驗守則》定義之基因轉殖植物。b.即使經過篩選剃除外源基因(啟動子與Cas9基因)，其子代在田間試驗階段應受《基因轉移植物田間試驗管理規範》第二條第四項「基因轉殖作物包含其衍生之後代」所規範管理。 4.隔離田間試驗設施營運管理。農委會於109年7月28日委託臺灣大學訪視本所基因轉殖植物田間試驗隔離設施建議改善事項，提出對應改善措施。本所已依建議事項完成改善。 5.基改作物隔離設施活化利用。對於農業生產而言，極端天氣變化， 使得糧食生產環境變得更為挑戰， 進而影響糧食供應的不確定性 ，牽動著國內外糧食供應政策與應變機制。建置能控制栽培環境的篩選平台，期能在多變的環境下瞭解其對作物的影響，進而提出對應的調適作為，以確保農業生產安全。配合作物溫度逆境研究需求，利用密閉溫室之人工光源室已完成水稻低溫逆境篩選設施平台建置，未來將進行水稻苗期低溫韌性篩選研究及抽穗期低溫逆境調適作為，以減少水稻溫度逆境損失，提升水稻育種選拔效率和隔離設施使用率。110年度將持續規劃建置高溫、高CO2濃度篩選設施，提升隔離設施使用率。目前已完成水稻高溫、高CO2濃度、多重逆境篩選設施資料蒐集、場域整理及規劃。 |